侵袭性真菌病(invasive fungal disease， IFD)是一类由真菌感染引起的示寂率较高的感染性疾病，多见于骨髓移植受者、实体器官移植受者、艾滋病患者等免疫功能受损的患者极品熟女，其临床预后有赖于早期会诊和有用的抗真菌药物诊疗[1-2]。当今临床上用于诊疗IFD的抗真菌药物有唑类、棘白菌素类、多烯类和氟胞嘧啶。其中，多烯类抗真菌药两性霉素B(amphotericin B， AMB)自20世纪50年代问世以来，尽管存在严重的肾毒性，但因其抗菌谱广、耐药性低，被平时用于诊疗曲霉、隐球菌、假丝酵母(念珠菌)、毛霉、球孢子菌等引起的侵袭性真菌感染(invasive fungal infections， IFIs)[3-4]。为克服其毒反作用，对AMB进行结构阅兵并发展出了脂质剂型的AMB[5-7]，当今已应用于临床推行。
金瓶梅在线病原性土曲霉对AMB自然耐药[8]，新近还有耐AMB的构巢曲霉和黄曲霉引起感染的报谈[9-11]。既往觉得，AMB通过径直作用于真菌细胞膜上的麦角固醇而引起膜通透性加多，最终进展抗真菌作用，但详备的作用机制仍然不了了。最近有学者在土曲霉对AMB耐药性方面进行了系列相干[12-17]，建议了土曲霉对AMB耐药的新机制，还对AMB在土曲霉中的作用机制建议新不雅点[13]。这些相干自然是针对土曲霉的，但关于意志AMB在临床上其他病原性曲霉中的作用机制和耐药机制也具有辛苦的鉴戒意思意思。本文针对这方面的相干进展进行综述。
1 AMB的杀菌作用机制以往觉得，AMB通过特异性联结真菌细胞膜上辛苦的脂质组分麦角固醇而镶嵌细胞膜中，造成跨膜离子通谈(离子通谈模子)，进而导致细胞膜通透性加多、钾离子外流进展其杀菌活性[18-21]；进一步相干觉得，AMB主要通过在细胞膜名义径直联结麦角固醇(名义吸附模子)，或通过团员造成庞大的膜外团员物(固醇海绵模子)、从膜磷脂双分子层中吸附并绑定麦角固醇而进展杀真菌作用，而跨膜离子通谈的作用较小[22-23]；与此同期，AMB造成的膜外团员物也联结东谈主体细胞膜上的胆固醇，这是导致其毒性作用的主要原因[24]。最近相干揭示，AMB通过影响土曲霉线粒体呼吸链功能，导致细胞内源性活性氧(reactive oxygen species， ROS)加多，引起细胞内氧化挫伤，从而进展其抗真菌作用[25]。
1.1 真菌线粒体呼吸链结构真菌细胞中线粒体内膜包含5个呼吸链膜卵白复合体[26-27](见图 1)。
复合体Ⅰ：复原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide，NADH)-泛醌复原酶，由至少35个亚基组成，其中7个主要亚基为线粒体基因编码，其余附属亚基为核基因编码。这些亚基在线粒体内膜上共同参与拼装组成复合体Ⅰ并保管其褂讪，调控其活性。复合体Ⅰ催化NADH的电子传递给泛醌，并将质子由线粒体基质转移至线粒体膜转折中。
复合体Ⅱ：又称琥珀酸-泛醌复原酶，由4个亚基组成，均由核基因编码，可氧化琥珀酸生成延胡索酸，并将电子传递给泛醌，但并不随同质子转移。
复合体Ⅲ：泛醌-细胞色素C复原酶，由10个亚基组成，其中1个为线粒体编码，其余由核基因编码，其作用是将泛醌捎带的电子传递给细胞色素C。
复合体Ⅳ：细胞色素C氧化酶，由12个亚基组成，其中4个亚基为线粒体基因编码，其余为核基因编码，其作用是催化氧分子生成水。
复合体V：即三磷酸腺苷(adenosine-triphosphate，ATP)合成酶，由F0、F1子复合体组成，其作用是愚弄复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ产生的跨膜质子梯度来合成ATP。
1.2 真菌呼吸链上的电子传递来自NADH的电子经由复合体Ⅰ传递给泛醌，来自琥珀酸的电子经由复合体Ⅱ传递给泛醌，泛醌袭取复合体Ⅰ、Ⅱ的电子生成复原性泛醌，并接续将电子传递给复合体Ⅲ，复合体Ⅲ上的电子经由细胞色素C传递给复合体Ⅳ，进一步将电子传递给氧分子，催化氧分子生成水。复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ在传递电子的同期，可将质子从线粒体基质泵入膜转折中，在线粒体内膜两侧产生质子电化学梯度，复合体V愚弄这一质子电化学梯度催化二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)和无机磷酸生成ATP[28]。同期，复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亦然产生ROS的主要部位[29-30]。
生理情况下，电子在呼吸链上传递时会有极少漏出，从而使氧径直袭取单电子并生成O2-·，O2-· 进一步生成HO2-·、H2O2、OH-等ROS[31]。ROS是线粒体呼吸链上电子传递进程中的自然“副家具”，可充任信号分子参与细胞内的信号转导、代谢合乎、自噬等进程[32-33]；但在药物作用、外界应激和线粒体呼吸链受遏制等非生理状况下，ROS生成量急剧加多，引起细胞内氧化挫伤，并最终导致真菌细胞的软弱和凋一火[34]。
除上述经典呼吸链上的复合体Ⅰ~Ⅳ外，土曲霉线粒体氧化磷酸化系统中还存在一类替代氧化酶(alternative oxidase， AOX)，包括AOX1和AOX2，由核基因编码。AOX位于线粒体内膜，可绕过复合物Ⅲ和Ⅳ而袭取复合体Ⅰ、Ⅱ传递给泛醌的电子，从而将氧复原为水，但较少生成ROS；这一替代氧化进程并不随同质子的跨膜转移，因此较少产生ATP[27]。
真菌在高能量需求或指数滋始终时，由经典复合体Ⅰ~Ⅳ道路进行电子传递，可产生多量ATP自尊滋长需要；而在粗劣量需求或褂讪滋长阶段，则由AOX替代道路进行电子传递，生成水和极极少ATP，ROS生成也少[35-36]。
1.3 AMB对真菌线粒体呼吸链的作用经AMB作用的敏锐土曲霉(susceptible Aspergillus terreus， ATS)产生多量内源性ROS，菌落滋长受到显然遏制[12]，这种情况在对AMB敏锐的烟曲霉[37]和念珠菌[38]中亦可见到；抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine， NAC)为非特异性巯基供体，可断根ROS，进展抗氧化作用[39]；连合使用NAC和AMB可裁减内源性ROS积聚水平，并使AMB对ATS的最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration， MIC)升高，教导AMB通过引起ATS产生内源性ROS而进展抗真菌作用。进一步相干发现，AMB作用的ATS中，差异以ndufs1(复合体Ⅰ亚基)、sdhc(复合体Ⅱ亚基)、cytc1(复合体Ⅲ亚基)、cox15(复合体Ⅳ亚基)基因的转录水平代表的复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ抒发水平均显然加多，标明AMB不错促进复合体Ⅰ~Ⅳ的抒发，增强线粒体呼吸链的功能。愚弄遏制剂萎锈灵(复合体Ⅱ遏制剂)、抗霉素A(复合体Ⅲ遏制剂)、氰化钾(复合体Ⅳ遏制剂)差异遏制复合体Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ时，并未影响ATS对AMB的敏锐性，但愚弄鱼藤酮(复合体Ⅰ遏制剂)遏制复合体Ⅰ后可使AMB的MIC升高[12]，AMB引起的内源性ROS的产生显然裁减。
要而论之，AMB可增强线粒体复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的功能，并通过增强复合体Ⅰ的功能促进内源性ROS产生，从而进展抗真菌作用。
2 病原真菌对AMB的耐药机制 2.1 麦角固醇合成道路中基因的作用已报谈白念珠菌、光滑念珠菌、新式隐球菌、土曲霉、黄曲霉、烟曲霉等对AMB可产生耐药性[3]。在酵母菌中，麦角固醇合成道路中的一系列基因的缺失或突变(包括erg1、erg2、erg3、erg4、erg6和erg11等)[40]可影响细胞膜上固醇类的生物合成，进而导致细胞膜上麦角固醇含量减少，由于缺少可替代的中间家具供AMB靶向联结，从而导致对AMB耐药[3]。比喻，Vincent等[41]通过全基因组测序发现，临床分离的耐AMB的白念珠菌存在erg2或erg6突变，热带念珠菌存在erg3和erg11双突变，通过差异构建上述基因定向敲除菌株，讲明上述erg基因突变可导致对AMB耐药。
然而，Blum等[13-14]发现临床分离的ATS、AMB自然耐药株(resistant Aspergillus terreus， ATR)及对AMB敏锐的烟曲霉(susceptible Aspergillus fumigatus， AFS)菌株细胞膜麦角固醇的含量并无各异，教导土曲霉对AMB耐药的机制与麦角固醇含量无关，与上述酵母菌中的情况不同。
2.2 热休克卵白的作用热休克卵白90(heat shock protein 90， Hsp90)是平时存在于真核细胞中的进化上高度保守的分子伴侣卵白，由N端结构域(amino-terminal domain， NTD)、中间结构域(middle domain， MD)、C端结构域(carboxy-terminal domain， CTD)及MEEVD(Met-Glu-Glu-Val-Asp)基序组成，其中：NTD讲求联结ATP；MD讲求联结客户卵白(client proteins)并匡助后者正确折叠，造成老练、褂讪的构象；CTD讲求造成Hsp90二聚体；而MEEVD基序则主要联结共伴侣分子(co-chaperones)，后者不错补助客户卵白的正确折叠。在酿酒酵母中，Hsp90不错与约10%的卵白相互作用[42-43]，通过调治其客户卵白如转录因子、激酶过火他信号转导因子的折叠、转运、老练和降解，从而平时参与细胞内信号通路的调治以及合乎性表型的产生和保管[43]。
Hsp90可通过MD结构域径直与其客户卵白钙调磷酸酶(calcineurin)的催化亚单元相互作用，匡助后者保管构象褂讪。钙调磷酸酶是一种Ca2+-钙调卵白(calmodulin， CaM)调治的丝氨酸/苏氨酸卵白磷酸酶，在菌丝滋长、刺激合乎、菌核和附着孢发育及胞壁好意思满性的调治中进展辛苦作用[44-45]。在大多数丝状真菌中[46-48]，钙调磷酸酶是由一个催化亚基CnA和一个调治亚基CnB组成的异二聚体，CnA亚基包含催化结构域(catalytic domain)、CnB联结域(CnB binding domain)、CaM联结域(CaM binding domain)和本人遏制域(auto-inhibitory domain， AID)共4个结构域；CnB亚基是一种Ca2+联结卵白，联结Ca2+后可造成精良构象，引起CnA亚基中AID及催化结构域的构象变化和活性位点败露，匡助其进展催化功能。
Cowen等[49]讲明Hsp90通过快速选用机制，在多种真菌耐药突变及表型的产生和保管进程中进展辛苦作用，但不同种的真菌影响的药物种类不同：遏制Hsp90或calcineurin可显然裁减由临床分离的白念珠菌对氟康唑和伏立康唑的耐药性，但其对卡泊芬净的敏锐性无显然影响；违反，遏制Hsp90或calcineurin可显然裁减泥土平分离的土曲霉菌株对卡泊芬净的耐药性，但并未影响其对氟康唑的耐药性。在体外，Hsp90遏制剂格尔德霉素(geldanamycin) 或其养殖物17-dimethylaminoethylamino- 17-demethoxygeldanamycin (17-DMAG)与AMB具有协同作用，可权贵裁减AMB对ATR的MIC；AMB与钙调磷酸酶遏制剂环孢素A联用也具有相同的作用；与AFS比拟，ATR和ATS具有更高的Hsp90基础抒发水平，这一丝可能使土曲霉对AMB引起的细胞膜应激和环境变化具有更强的合乎性[15]，说明Hsp90或钙调磷酸酶活性增强促进了土曲霉对AMB所致应激的合乎性。
热休克卵白70(heat shock protein 70， Hsp70)家眷是另一类与Hsp90共同组成细胞内监视收集的分子伴侣，除古生菌外皮扫数物种中高度保守，其家眷成员N端均含有高度保守的核苷酸联结结构域(NBD)及位于C端的序列多变的底物联结结构域[16]。比拟于Hsp90，Hsp70的靶卵白愈加散乱，且不错与未折叠、造作折叠及相互聚拢的底物卵白相互作用，匡助其正确折叠并保管卵白质的褂讪性[50]。当体外败露于AMB的ATR中，Hsp70家眷成员ssa和ssb的量在转录水和睦卵白质水平均权贵升高；愚弄遏制剂pifithrin-μ遏制Hsp70后，AMB对ATR的MIC显然裁减(从≥32 μg/mL降至≤1 μg/mL)；连合使用AMB和pifithrin- μ诊疗感染ATR的大蜡螟，可改善疗效，提升生涯率[16]，也说明了这种协同作用。Hsp70活性增强，可促进AMB的耐药性；而遏制Hsp70活性可动作诊疗ATR引起侵袭性曲霉病的潜在相干标的。
2.3 线粒体氧化磷酸化系统的作用比较ATS和ATR时发现：未败露于AMB时，ATS的基础耗氧速率是ATR的3.3倍，其线粒体拷贝数更高(高约23%)，滋长速率更快[12]，毒力更强[51-52]，这与敏锐菌株滋长快、毒力强的模式是一致的[41]；败露于AMB时，ATS的线粒体拷贝数进一步加多，内源性ROS多量产生，而ATR的线粒体拷贝数进一步减少，内源性ROS产生水平更低[12]。由于线粒体拷贝数的多寡与线粒体呼吸链活性高下一致，因此当ATR中线粒体拷贝数减少时，其耗氧速率裁减，相应地内源性ROS生成减少，从而导致耐药性增强。
进一步相干发现[12]，败露于AMB的ATS线粒体复合体Ⅰ抒发水平权贵升高，aox抒发水平轻度升高，ROS的生成增多；败露于AMB的ATR的线粒体复合体Ⅰ抒发水平仅轻度升高，而AOX抒发水平权贵升高，ROS的生成相对减少。如前所述，复合体Ⅰ活性的裁减可减少ATS中ROS的生成，AOX高抒发也可能参与遏制ROS生成[35-36]；进一步愚弄水杨羟肟酸(salicylhydroxamic acid， SHAM)遏制ATR中AOX的活性，则内源性ROS水平显然加多、AMB的MIC显然下落[12]，再次教导AOX的高抒发可导致ATR中ROS生成减少，产生耐药性，因此AOX可动作抗真菌药物的潜在靶点。
总之，AMB通过增强呼吸链经典道路中线粒体复合体Ⅰ的功能而促进真菌细胞产生内源性ROS，最终进展抗真菌作用。败露于AMB的ATR中，呼吸链经典道路中线粒体复合体Ⅰ抒发水平仅轻度升高，不足ATS中权贵；而替代道路AOX功能权贵增强，内源性ROS生成相对减少，最终产生耐药性。
2.4 ROS断根系统的作用ROS是真核细胞呼吸链进程中产生的无益物资，实时断根ROS关于保管其正常的生命步履具有辛苦作用。真核细胞中存在多种ROS断根系统，包括超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、过氧化氢酶(catalase， CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase， GPX)等。当细胞内源性ROS生成增多引起氧化应激时，可指引上述ROS断根酶的抒发，减少细胞内的氧化挫伤[26]。
相干标明，未败露于AMB时[52]，ATR中SOD的活性约为ATS中的2倍，而CAT抒发水平无显然各异，说明ATR较ATS断根ROS的智商更强；败露于AMB后，ATS中SOD和CAT的抒发水平无显然变化，但在ATR中均显然加多，说明AMB可促使ATR增强对ROS的断根智商。愚弄遏制剂N， N-二甲基二硫代氨基甲酸(N-N-diethyldithiocarbamate， DDC)和3-氨基-1， 2， 4-三氮唑(3-amino-1， 2， 4-triazole， 3-AT)差异遏制SOD和CAT的活性，均可使ATR中内源性ROS水平显然加多，AMB的MIC降至敏锐水平；且在ATS中，遏制SOD或CAT可使AMB的MIC进一步裁减。总之，ATR中SOD和CAT活性增强，可快速断根内源性ROS，是ATR对AMB耐药的可能机制之一；且遏制真菌SOD和CAT活性，可动作潜在的抗真菌诊疗靶点。
3 结语如图 2回想所示，AMB的抗真菌作用机制包括：①AMB径直联结真菌细胞膜麦角固醇和(或)造成细胞膜离子通谈，防止真菌细胞膜结构的好意思满性，影响细胞表里离子水和睦浸透压编削；②AMB加多土曲霉线粒体拷贝数，增强线粒体呼吸链经典道路中复合体Ⅰ的活性，产生多量内源性ROS，从而引起真菌细胞的氧化挫伤。
病原真菌对AMB的耐药机制包括：①酵母中麦角固醇合成道路基因突变或缺失极品熟女，导致细胞膜麦角固醇含量减少而使靶向联结物缺少；②土曲霉平分子伴侣Hsp90、钙调磷酸酶及Hsp70的活性升高，增强了其对AMB所致应激的合乎性；③土曲霉线粒体拷贝数减少，耗氧速率裁减，内源性ROS生成减少；④土曲霉经AMB作用后，呼吸链经典道路中线粒体复合体Ⅰ活性无权贵升高，同期替代道路AOX功能权贵增强，内源性ROS生成减少；⑤土曲霉ROS断根酶CAT、SOD活性增强所致的内源性ROS断根增强。